Vector de clonaje

El vector elegido para realizar el clonaje de la ECP es el plásmido pET41a, mostrado en la siguiente imagen encontrada en NOVAGEN:

Figura 26: Vector de clonaje pET41a

Este vector permite hacer una proteína de fusión añadiendo una His-tag en el extremo C-ter de la secuencia a clonar. Otra posibilidad es hacer una proteína quimérica añadiendo GST en el extremo N-ter. Esta segunda opción es la que escogemos para el clonaje deseado porque presenta varias ventajas. (Ver Estrategia de purificación). 

El plásmido pET41a presenta resistencia al antibiótico kanamicina, lo que permite seleccionar las células que han incorporado el plásmido en el proceso de transformación simplemente haciendo el cultivo en un medio que contenga este antibiótico.

Para la expresión de proteínas heterólogas en E.coli son muy utilizados los plásmidos pET: plasmid for expresión by T7 RNA polimerasa. El promotor que se usa es el que reconoce la T7 polimerasa. Lo que inicia la expresión del gen es la T7 RNA polimerasa, que no es una polimerasa de E.coli, sino del fago T7. El sistema tiene que conseguir que esa T7 RNA polimerasa esté en las bacterias huésped.

Figura 27: Control de elementos del sistema pET

Dentro de la zona donde se va a poder clonar, el vector tiene el promotor T7 (se ha añadido la zona del operón lactosa, de manera que puede ser inducido por IPTG): es un promotor quimérico. Detrás del promotor es donde clonamos el gen en cuestión, que en esta caso será la secuencia de cDNA de la ECP. Este promotor tiene que ser reconocido por la RNApol de T7, que no está en cepas de E.coli. Por tanto, las cepas huésped utilizadas deberán tener introducido el gen de la RNApol de T7. Un ejemplo de este tipo de cepas es E.coli BC21 (DE3) pLys. Son cepas lisogenizadas con λDE3. En este lambda integrado es donde se ha introducido el gen de la T7 RNA polimerasa, de nuevo bajo el promotor lac, de manera que la polimerasa solo se expresa cuando se pone IPTG en el medio.

Una vez se haya clonado el gen, en principio está reprimido hasta que no se suministre IPTG. que no pongamos IPTG, está todo reprimido. El IPTG actúa a dos niveles: proteía recombinante y T7 polimerasa. Al añadir IPTG, ocurren dos cosas. Se induce la expresión de la T7 polimerasa, que reconocerá el promotor del plásmido, a su vez inducido por IPTG.

Hay un pequeño matiz que permite una mejora del sistema. Existen cepas que contienen otro pequeño plásmido sintético (pLys) que permite una mejora del sistema. pLys contiene el gen que expresa la lisozima de fago T7, un inhibidor natural de la T7 polimerasa. Así, se evita la expresión del gen diana en ausencia de IPTG, que puede producirse a causa de una expresión basal, ya que la represión no es completa. Con el plásmido adicional, se consigue que la represión sea completa hasta el momento en que se desee la expresión. Este hecho es importante sobre todo cuando se trabaja con proteínas tóxicas. Una vez se añade IPTG, la expresión de la T7 polimerasa es masiva y la inhibición no afecta, pues hay suficientes polimerasas libres.

Debido a que el sistema de expresión escogido es E.coli, no se producirán las modificaciones postraduccionales que presenta la ECP humana (glicosilaciones, nitraciones, puentes disulfuro). Así, esto será una diferencia importante que habrá que tener en cuenta.