Clonaje

 Para amplificar el cDNA del gen de la ECP se deben seguir, de forma resumida, los siguientes pasos:

1. Obtención de muestras, extracción del RNA total
2. Diseño de cebadores para la realización de RT-PCR
3. RT-PCR
4. Purificación de productos de la PCR
5. Digestión con enzimas de restricción. Inhibición de los enzimas de restricción
6. Ligación
7. Transformación de la cepa seleccionada y plaqueo en placas con kanamicina para seleccionar las células que han incorporado el vector
8. Preparación de cultivo
9. Extracción del DNA plasmídico y digestión con enzimas de restricción
10. Electroforesis de DNA para interpretar los resultados

Si los resultados son positivos y se ha conseguido introducir en las células el vector de expresión con la secuencia de la proteína, se realizará un proceso a mayor escala para obtener buena cantidad de producto, seguido de la purificación del mismo.

Diseño de primers

El vector pET41a permite crear una proteína de fusión, colocando GST (Glutatión S Transferasa en el extremo N-terminal de la secuencia codificante de la proteína de interés, en este caso la ECP (Ver vector de clonaje). Para realizar este clonaje, se han de buscar los enzimas de restricción adecuados, que estén presentes en los sitios correctos del vector y que no corten en la secuencia codificante de la proteína.

En este sentido, en primer lugar se localiza el ORF con el programa ORF Finder a partir de la secuencia de cDNA (Ver información general).

Figura 20: ORF Finder con ORF seleccionado

El ORF marcado de rosa es el correcto. Su secuencia en formato FASTA se muestra a continuación:

>lcl|Sequence 1 ORF:285..767 Frame +3

ATGGTTCCAAAACTGTTCACTTCCCAAATTTGTCTGCTTCTTCTGTTGGGGCTTATGGGTGTGGAGGGCTCACTCCATGCCA

GACCCCCACAGTTTACGAGGGCTCAGTGGTTTGCCATCCAGCACATCAGTCTGAACCCCCCTCGATGCACCATTGCAATGCG

GGCAATTAACAATTATCGATGGCGTTGCAAAAACCAAAATACTTTTCTTCGTACAACTTTTGCTAATGTAGTTAATGTTTGT

GGTAACCAAAGTATACGCTGCCCTCATAACAGAACTCTCAACAATTGTCATCGGAGTAGATTCCGGGTGCCTTTACTCCACT

GTGACCTCATAAATCCAGGTGCACAGAATATTTCAAACTGCACGTATGCAGACAGACCAGGAAGGAGGTTCTATGTAGTTGC

ATGTGACAACAGAGATCCACGGGATTCTCCACGGTATCCTGTGGTTCCAGTTCACCTGGATACCACCATCTAA

De color amarillo se ha marcado la secuencia correspondiente al péptido señal (27 aminoácidos; 81 nucleótidos); en rojo, el codón Stop.

Los enzimas de restricción adecuados para conseguir una proteína de fusión serán SpeI y AvrII. En Nebcutter se comprueba que estos enzimas no cortan dentro de la secuencia codificante. Efectivamente, ambos enzimas no presentan ningún corte en esta secuencia. Así, pueden ser utilizados para el clonaje:

Figura 21: Enzimas de restricción

A partir de aquí, se diseñan los primers para el clonaje.

Se diseñarán a mano y posteriormente se analizan para comprobar que son correctos con el programa NetPrimer. A la hora de hacer el clonaje, el péptido señal ha de eliminarse, pues la proteína funcional no lo presenta. Por ello, habrá que diseñar los primers de manera que no se amplifique ese fragmento.

Se ha colocado una cola con la diana de restricción para el enzima SpeI más unos cuantos nucleótidos espaciadores necesarios para que el enzima de restricción pueda actuar.

Características del primer:

Figura 22: Características primer forward

Se ha colocado la secuencia complementaria a la diana de restricción (al ser palindrómica es la misma secuencia). Tras esta, se coloca la secuencia complementaria del cDNA, añadiendo el codón Stop (rojo) para uqe la proteína no presente nada adicional en el extremo C-terminal. 

Características del primer:

Figura 23: Características primer reverse

Como se observa, son primers compatibles porque presentan una temperatura de fusión (Tm) muy similar, hecho imprescindible para que puedan hibridar ambos en el proceso de PCR.

Posibles problemas:

Se pueden formar dímeros entre el mismo primer, pero esto resulta inevitable debido a que se introduce una diana de restricción palindrómica. La imagen siguiente muestra un ejemplo del dímero que se produce entre primers reverse.

Figura 24: Dímero primers reverse

Por otro lado, se observa que se obtiene un cross-dimer, pero no afecta a la zona 3’ y su energía libre no es excesivamente baja. Por tanto se considera que la pareja de primers es correcta.

Figura 25: Cross-Dimer