Estrategia de purificación

Normalmente las secuencias de purificación siguen las siguientes fases:

Figura 28: Principales fases del proceso de purificación

En primer lugar, una vez ha finalizado el cultivo, se realizará una separación líquido-sólido, por ejemplo con una centrifugación. La proteína de interés no es secretada por la célula, por lo que habrá que quedarse con la fracción sólida y realizar una disrupción celular. En este sentido se pueden utilizar diferentes métodos, siendo los más apropiados a gran escala el homogeneizador de alta presión o el molino de bolas. El siguiente paso será una nueva concentración (centrifugación + filtración) para eliminar los restos celulares. Ahora interesa la fracción líquida, donde quedará presente la proteína de interés.

A la hora de purificar la proteína heteróloga expresada en el cultivo de E.coli, se aprovechará la presencia de GST en el extremo N-terminal de la misma.

Esto aporta diferentes ventajas:

Al estar fusionada GST se mejora el plegamiento de la proteína de interés. A veces proteínas que se expresan solas se acumulan en cuerpos de inclusión, lo que se evita con la fusión de GST. El plegamiento de GST y la proteína en cuestión es independiente, y por tanto, esta fusión no afectará al plegamiento de la ECP, pues están juntas pero forman dominios diferentes. El hecho de que GST se pliegue, ayuda al plegamiento de lo que va detrás (no siempre, pero a veces se soluciona el problema de los cuerpos de inclusión). 

Otra ventaja muy importante es que permite una sencilla purificación de la proteína resultante por el hecho de que nuestra proteína esta fusionada a GST. La GST tiene afinidad por el glutatión y se puede purificar por una cromatografía de afinidad. Dentro de la columna habrá bolas de agarosa a las que se ha unido covalentemente glutatión.  Si se añade el extracto de la bacteria, se queda unida GST y por tanto, se queda unida toda la proteína quimérica. Se aplica el extracto proteico, se hace un lavado y lo que no queda fijado se va. Así, solo se queda la proteína quimérica que se puede eluir después con glutatión, ya que este compite con la unión. La proteína quimérica se suelta de la columna y se recoge. En un único paso podemos purificar esta proteína de fusión del resto de proteínas que hay en la bacteria. En este momento, se tiene la proteína unida por N-ter a la GST. 

Figura 29: Purificación con GST

Se puede trabajar con la proteína de fusión, pero también es posible eliminar la GST y separar la ECP. Para esto existen proteasas específicas que separan las dos proteínas realizando un corte. Tras esto, se realizará una nueva cromatografía de afinidad, en la que quedará unida la GST y eluirá la ECP. 

En principio, con esta cromatografía podría ser suficiente para tener la proteína pura, pero es posible también añadir otros pasos de cromatografía, por ejemplo de gel filtración, o una electroforesis si se requiere una pureza muy elevada. 

Finalmente, se realizará la etapa de refinado si el producto se debe preparar de una determinada manera. 

El proceso de purificación queda resumido en el siguiente diagrama de flujo:  

Figura 30: diagrama de flujo del proceso de purificación