Mutagénesis dirigida

Mutagénesis dirigida

Mutación 1

En primer lugar, mutaremos un aminoácido catalítico, en concreto la Lys38 y la cambiaremos por un aminoácido con carga negativa, Asp (K38D), para poder observar más claramente el efecto de la mutación en la función de la proteína. El programa usado es Primer X.

Los primers encontrados son los siguientes:

Figura 31: Primers mutagénesis K38D

Tras expresar esta proteína y purificarla, comprobaríamos si conserva o no su actividad ribonucleasa. Una primera aproximación sería comprobar si la proteína conserva o no su plegamiento nativo.  Esto se puede analizar en Fold Index.

La secuencia de la proteína ECP normal es la siguiente:

RPPQFTRAQWFAIQHISLNPPRCTIAMRAINNYRWRCKNQNTFLRTTFANVVNVCGNQSIRCPH

NRTLNNCHRSRFRVPLLHCDLINPGAQNISNCTYADRPGRRFYVVACDNRDPRDSPRYPVVPVH

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Figura 32: Proteína normal. En verde la parte plegada y en rojo la desplegada

La secuencia de la proteína mutada será la siguiente;

RPPQFTRAQWFAIQHISLNPPRCTIAMRAINNYRWRCDNQNTFLRTTFANVVNVCGNQSIRCPH
NRTLNNCHRSRFRVPLLHCDLINPGAQNISNCTYADRPGRRFYVVACDNRDPRDSPRYPVVPVH
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Figura 33: Proteína mutada K38D. En verde la parte plegada y en rojo la desplegada

Comparando los resultados de la secuencia original y la mutada, se observa que son bastante similares, y el aminoácido mutado no está en áreas ordenadas de la proteína. Se puede pensar entonces que la proteína continuará con su plegamiento nativo y habría que buscar alguna manera experimental para determinar si conserva su funcionalidad.

Mutación 2

Otra mutación que podría ser interesante sería cambiar algún aminoácido importante para alguna de las estructuras secundarias. En este sentio, cambiamos Ala110 por un Trp. La alanina es un aminoácido pequeño que en la ECP está formando parte de una lámina B que se encuentra muy conservada en las proteínas de la familia (Ver multialineamiento). El triptófano es un aminoácido muy voluminoso, lo que ayudará a comprobar si el cambio afecta considerablemente a la estructura o no.

Los primers necesarios para realizar esta mutagénesis son los siguientes:

Figura 34: Primers mutagénesis A110W

La secuencia de la proteína mutada será la siguiente:

RPPQFTRAQWFAIQHISLNPPRCTIAMRAINNYRWRCKNQNTFLRTTFANVVNVCGNQSIRCPH
NRTLNNCHRSRFRVPLLHCDLINPGAQNISNCTYADRPGRRFYVVWCDNRDPRDSPRYPVVPVH
LDTTI

El resultado del programa Fold Index es el siguiente:

Figura 35: Proteína mutada A110W. En verde la parte plegada y en rojo la desplegada

Si se compara con la proteína normal, no se observan cambios importantes.

Otro programa que permite analizar la susceptibilidad de formar agregados (Hot spots) es el Aggrescan. Comparando el área normalizada con alta probabilidad de agregar de la  proteína wt y la mutada, tampoco se aprecian diferencias.

Figura 36: Área normalizada de los HotSpots de la proteína wt

Figura 37: Área normalizada de los HotSpots de la proteína mutada A110W

Mutación 3

Se ha comprobado que mutar I13 (I40 en la secuencia con péptido señal) por A evita la agregación de la proteína (Estudio). En este sentido, hemos diseñado los primers que serían necesarios para realizar dicha mutagénesis y hemos comprobado los resultados.

Figura 38: Primers mutagénesis I13A

La secuencia de la proteína mutada será la siguiente:

RPPQFTRAQWFAAQHISLNPPRCTIAMRAINNYRWRCKNQNTFLRTTFANVVNVCGNQSIRCPH
NRTLNNCHRSRFRVPLLHCDLINPGAQNISNCTYADRPGRRFYVVACDNRDPRDSPRYPVVPVH
LDTTI

Usando el programa Aggrescan vamos a ver si se produce la eliminación de la primera zona de agregación explicada en el estudio. 

Figura 39: Área normalizada de los HotSpots de la proteína wt

Figura 40: Área normalizada de los HotSpots de la proteína mutada I13A

Como se puede observar en las imágenes, la proteína mutada no tiene la primera zona de agregación, que tal y como se menciona en el experimento, es la que desaparece. Es por ello, que en este caso sí podemos afirmar que la herramienta bioinformática nos ayuda a predecir qué puede pasar al hacer una mutagénesis dirigida.