Mutagénesis dirigida
Mutación 1
En primer lugar, mutaremos un aminoácido
catalítico, en concreto la Lys38 y la cambiaremos por un aminoácido con carga
negativa, Asp (K38D), para poder observar más claramente el efecto de la mutación en
la función de la proteína. El programa usado es Primer X.
Los primers encontrados son los siguientes:
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| Figura 31: Primers mutagénesis K38D |
Tras expresar esta proteína y purificarla, comprobaríamos
si conserva o no su actividad ribonucleasa. Una primera aproximación sería
comprobar si la proteína conserva o no su plegamiento nativo. Esto se puede analizar en Fold Index.
La secuencia de la proteína ECP normal es la siguiente:
RPPQFTRAQWFAIQHISLNPPRCTIAMRAINNYRWRCKNQNTFLRTTFANVVNVCGNQSIRCPH
NRTLNNCHRSRFRVPLLHCDLINPGAQNISNCTYADRPGRRFYVVACDNRDPRDSPRYPVVPVH
LDTTI
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| Figura 32: Proteína normal. En verde la parte plegada y en rojo la desplegada |
La secuencia de la proteína mutada será la
siguiente;
RPPQFTRAQWFAIQHISLNPPRCTIAMRAINNYRWRCDNQNTFLRTTFANVVNVCGNQSIRCPH
NRTLNNCHRSRFRVPLLHCDLINPGAQNISNCTYADRPGRRFYVVACDNRDPRDSPRYPVVPVH
LDTTI
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| Figura 33: Proteína mutada K38D. En verde la parte plegada y en rojo la desplegada |
Comparando los resultados de la secuencia original
y la mutada, se observa que son bastante similares, y el aminoácido mutado no
está en áreas ordenadas de la proteína. Se puede pensar entonces que la
proteína continuará con su plegamiento nativo y habría que buscar alguna manera
experimental para determinar si conserva su funcionalidad.
Mutación 2
Otra mutación que podría ser interesante
sería cambiar algún aminoácido importante para alguna de las estructuras
secundarias. En este sentio, cambiamos Ala110 por un Trp. La alanina es un
aminoácido pequeño que en la ECP está formando parte de una lámina B que se
encuentra muy conservada en las proteínas de la familia (Ver
multialineamiento). El triptófano es un aminoácido muy voluminoso, lo que
ayudará a comprobar si el cambio afecta considerablemente a la estructura o no.
Los primers necesarios para realizar esta
mutagénesis son los siguientes:
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| Figura 34: Primers mutagénesis A110W |
La secuencia de la proteína mutada será la siguiente:
RPPQFTRAQWFAIQHISLNPPRCTIAMRAINNYRWRCKNQNTFLRTTFANVVNVCGNQSIRCPH
NRTLNNCHRSRFRVPLLHCDLINPGAQNISNCTYADRPGRRFYVVWCDNRDPRDSPRYPVVPVH
LDTTI
El resultado del programa Fold Index es el siguiente:
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| Figura 35: Proteína mutada A110W. En verde la parte plegada y en rojo la desplegada |
Si se compara con la proteína normal, no se observan cambios importantes.
Otro programa que permite analizar la
susceptibilidad de formar agregados (Hot spots) es el
Aggrescan. Comparando el
área normalizada con alta probabilidad de agregar de la
proteína wt y la mutada, tampoco se aprecian
diferencias.
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| Figura 36: Área normalizada de los HotSpots de la proteína wt |
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| Figura 37: Área normalizada de los HotSpots de la proteína mutada A110W |
Mutación 3
Se ha comprobado que mutar I13 (I40 en la secuencia
con péptido señal) por A evita la agregación de la proteína (
Estudio). En
este sentido, hemos diseñado los primers que serían necesarios para realizar
dicha mutagénesis y hemos comprobado los resultados.
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| Figura 38: Primers mutagénesis I13A |
La secuencia de la proteína mutada será la siguiente:
RPPQFTRAQWFAAQHISLNPPRCTIAMRAINNYRWRCKNQNTFLRTTFANVVNVCGNQSIRCPH
NRTLNNCHRSRFRVPLLHCDLINPGAQNISNCTYADRPGRRFYVVACDNRDPRDSPRYPVVPVH
LDTTI
Usando el programa Aggrescan vamos a ver si se produce la eliminación de la primera zona de agregación explicada en el estudio.
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| Figura 39: Área normalizada de los HotSpots de la proteína wt | | |
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| Figura 40: Área normalizada de los HotSpots de la proteína mutada I13A |
Como se puede observar en las imágenes, la proteína
mutada no tiene la primera zona de agregación, que tal y como se menciona en el
experimento, es la que desaparece. Es por ello, que en este caso sí podemos afirmar
que la herramienta bioinformática nos ayuda a predecir qué puede pasar al hacer
una mutagénesis dirigida.
