Estrategia de purificación

Normalmente las secuencias de purificación siguen las siguientes fases:

Figura 28: Principales fases del proceso de purificación

En primer lugar, una vez ha finalizado el cultivo, se realizará una separación líquido-sólido, por ejemplo con una centrifugación. La proteína de interés no es secretada por la célula, por lo que habrá que quedarse con la fracción sólida y realizar una disrupción celular. En este sentido se pueden utilizar diferentes métodos, siendo los más apropiados a gran escala el homogeneizador de alta presión o el molino de bolas. El siguiente paso será una nueva concentración (centrifugación + filtración) para eliminar los restos celulares. Ahora interesa la fracción líquida, donde quedará presente la proteína de interés.

A la hora de purificar la proteína heteróloga expresada en el cultivo de E.coli, se aprovechará la presencia de GST en el extremo N-terminal de la misma.

Esto aporta diferentes ventajas:

Al estar fusionada GST se mejora el plegamiento de la proteína de interés. A veces proteínas que se expresan solas se acumulan en cuerpos de inclusión, lo que se evita con la fusión de GST. El plegamiento de GST y la proteína en cuestión es independiente, y por tanto, esta fusión no afectará al plegamiento de la ECP, pues están juntas pero forman dominios diferentes. El hecho de que GST se pliegue, ayuda al plegamiento de lo que va detrás (no siempre, pero a veces se soluciona el problema de los cuerpos de inclusión). 

Otra ventaja muy importante es que permite una sencilla purificación de la proteína resultante por el hecho de que nuestra proteína esta fusionada a GST. La GST tiene afinidad por el glutatión y se puede purificar por una cromatografía de afinidad. Dentro de la columna habrá bolas de agarosa a las que se ha unido covalentemente glutatión.  Si se añade el extracto de la bacteria, se queda unida GST y por tanto, se queda unida toda la proteína quimérica. Se aplica el extracto proteico, se hace un lavado y lo que no queda fijado se va. Así, solo se queda la proteína quimérica que se puede eluir después con glutatión, ya que este compite con la unión. La proteína quimérica se suelta de la columna y se recoge. En un único paso podemos purificar esta proteína de fusión del resto de proteínas que hay en la bacteria. En este momento, se tiene la proteína unida por N-ter a la GST. 

Figura 29: Purificación con GST

Se puede trabajar con la proteína de fusión, pero también es posible eliminar la GST y separar la ECP. Para esto existen proteasas específicas que separan las dos proteínas realizando un corte. Tras esto, se realizará una nueva cromatografía de afinidad, en la que quedará unida la GST y eluirá la ECP. 

En principio, con esta cromatografía podría ser suficiente para tener la proteína pura, pero es posible también añadir otros pasos de cromatografía, por ejemplo de gel filtración, o una electroforesis si se requiere una pureza muy elevada. 

Finalmente, se realizará la etapa de refinado si el producto se debe preparar de una determinada manera. 

El proceso de purificación queda resumido en el siguiente diagrama de flujo:  

Figura 30: diagrama de flujo del proceso de purificación

 

Vector de clonaje

El vector elegido para realizar el clonaje de la ECP es el plásmido pET41a, mostrado en la siguiente imagen encontrada en NOVAGEN:

Figura 26: Vector de clonaje pET41a

Este vector permite hacer una proteína de fusión añadiendo una His-tag en el extremo C-ter de la secuencia a clonar. Otra posibilidad es hacer una proteína quimérica añadiendo GST en el extremo N-ter. Esta segunda opción es la que escogemos para el clonaje deseado porque presenta varias ventajas. (Ver Estrategia de purificación). 

El plásmido pET41a presenta resistencia al antibiótico kanamicina, lo que permite seleccionar las células que han incorporado el plásmido en el proceso de transformación simplemente haciendo el cultivo en un medio que contenga este antibiótico.

Para la expresión de proteínas heterólogas en E.coli son muy utilizados los plásmidos pET: plasmid for expresión by T7 RNA polimerasa. El promotor que se usa es el que reconoce la T7 polimerasa. Lo que inicia la expresión del gen es la T7 RNA polimerasa, que no es una polimerasa de E.coli, sino del fago T7. El sistema tiene que conseguir que esa T7 RNA polimerasa esté en las bacterias huésped.

Figura 27: Control de elementos del sistema pET

Dentro de la zona donde se va a poder clonar, el vector tiene el promotor T7 (se ha añadido la zona del operón lactosa, de manera que puede ser inducido por IPTG): es un promotor quimérico. Detrás del promotor es donde clonamos el gen en cuestión, que en esta caso será la secuencia de cDNA de la ECP. Este promotor tiene que ser reconocido por la RNApol de T7, que no está en cepas de E.coli. Por tanto, las cepas huésped utilizadas deberán tener introducido el gen de la RNApol de T7. Un ejemplo de este tipo de cepas es E.coli BC21 (DE3) pLys. Son cepas lisogenizadas con λDE3. En este lambda integrado es donde se ha introducido el gen de la T7 RNA polimerasa, de nuevo bajo el promotor lac, de manera que la polimerasa solo se expresa cuando se pone IPTG en el medio.

Una vez se haya clonado el gen, en principio está reprimido hasta que no se suministre IPTG. que no pongamos IPTG, está todo reprimido. El IPTG actúa a dos niveles: proteía recombinante y T7 polimerasa. Al añadir IPTG, ocurren dos cosas. Se induce la expresión de la T7 polimerasa, que reconocerá el promotor del plásmido, a su vez inducido por IPTG.

Hay un pequeño matiz que permite una mejora del sistema. Existen cepas que contienen otro pequeño plásmido sintético (pLys) que permite una mejora del sistema. pLys contiene el gen que expresa la lisozima de fago T7, un inhibidor natural de la T7 polimerasa. Así, se evita la expresión del gen diana en ausencia de IPTG, que puede producirse a causa de una expresión basal, ya que la represión no es completa. Con el plásmido adicional, se consigue que la represión sea completa hasta el momento en que se desee la expresión. Este hecho es importante sobre todo cuando se trabaja con proteínas tóxicas. Una vez se añade IPTG, la expresión de la T7 polimerasa es masiva y la inhibición no afecta, pues hay suficientes polimerasas libres.

Debido a que el sistema de expresión escogido es E.coli, no se producirán las modificaciones postraduccionales que presenta la ECP humana (glicosilaciones, nitraciones, puentes disulfuro). Así, esto será una diferencia importante que habrá que tener en cuenta.